ATCC細(xì)胞單純的固定液一般難以達到這些要求，因此在實驗中使用兩種混和的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而稱的卡諾氏固定液是效果良好的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需臨時配制，長時間放置影響固定效果，固定時間15分鐘至24小時，冰箱、室溫均可。ATCC細(xì)胞必要時可改變甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于細(xì)胞膨脹、染色體鋪展，但易導(dǎo)致細(xì)胞破裂、染色體散失。

　　ATCC細(xì)胞材料和試劑:

　　1、細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株。

　　2、試劑：0.25％胰酶、1640培養(yǎng)基（含10％小牛血清）。

　　3、儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等。

　　ATCC細(xì)胞操作步驟:

　　1、將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去?！　　　?br />2、加入0.5―1ml0.25％胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。

　　3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。隨著時間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時將胰酶棄去，加入10ml培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時終止消化。一般室溫消化時間約為1―3分鐘。

　　4、用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況?！　　　「剑合号渲品椒ǎ骸　》Q取0.25克胰酶蛋白酶（活力為1：250），加入100ml無Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，濾器過濾除菌，4℃保存，用前可在37℃下回溫。胰酶溶液中也可加入EDTA，使zui終濃度達0.02％。

　　ATCC細(xì)胞在培養(yǎng)中使用的紡錘體阻斷劑為秋水仙素，在終止培養(yǎng)前加入適量秋水仙素，使正在分裂的細(xì)胞停留在中期，以獲得大量分裂相供分析之用。秋水仙素的濃度范圍比較寬，一般使用濃度0.05—0.8微克/毫升，在終止培養(yǎng)前處理2—4小時。但在實際工作中需要借助濃度和處理時間來控制染色體的收縮程度。秋水仙素作用時間越長，被阻斷的中期分裂相越多，但是ATCC細(xì)胞染色體也越凝聚和收縮，所以還視各實驗室經(jīng)驗而定。

 

>> 返回首頁